人类对核酸物质的了解始于1869年，这一年Friederich Miescher从白细胞的细胞核中分离出一种他称之为“核素”的化学物质，这是人类历史上第一次有目的地提取细胞内的核物质，然而当时采用的方法十分简单，仅仅是通过改变溶液的酸碱度，核酸便从酸性溶液中沉淀出来。这也是最早对核酸性质的描述，即是一种溶于碱性溶液，但不溶于酸性溶液的物质。1953年，Watson和Crick阐明了DNA的结构，从此开启了分子生物学的元年。此后不久，出现了分离核酸的标准实验室程序。1958年，发现DNA半保留复制原理的Meselson和Stahl开创性地应用密度梯度离心法获得DNA。这种方法利用离心力场中各组分的浮力密度差不同的原理进行DNA纯化。由于铯离子（Cs）相对于水的密度更大，施加到CsCl溶液的超高离心力导致形成密度梯度。核酸在这个梯度上迁移，直到达到中性浮力，即等密度点。该方法具有以低成本提供非常纯的高产DNA的优点。其它的液相纯化方法还包括经典的苯酚-氯仿法、CTAB法等。但直到二十世纪90年代，DNA提取仍然是耗时、繁琐、低效率的操作。1989年，McCormick建立了一种用酚化的二氧化硅吸附去除蛋白质的基因组DNA提取方法。它类似经典的酚/氯仿提取法，即用酚化的二氧化硅酚代替酚，这是最早出现的固相吸附提取方法。相比起液相抽提，固相吸附法的优势很明显，因此传统的液相分离提取核酸方法逐渐被以固相吸附支持物为基础的新方法所取代。目前常见固相材料有硅胶、玻璃颗粒、硅藻土、阴离子交换载体等。但固相法通常需采取数次快速离心、真空抽滤等步骤来实现分离，而且对于样本需求量大，耗费样品较多，不便于高通量、自动化操作，严重限制了在临床基因诊断领域的应用。理想的核酸提取方法应该满足以下4个条件：1）灵敏、快速、简单、重复性好；2）产物纯度较高，不影响后续步骤3）环保、无毒害4）无交叉污染风险磁珠法提取为了适应现代分子生物学检测实验高通量、高灵敏度、自动化操作的需要，磁珠法应运而生。第一个利用磁珠法提取DNA的并且在美国成功申请专利的商品化试剂出现在1998年。磁珠法先通过裂解细胞，将游离出来的核酸分子特异地吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质、多糖等杂质则留在溶液中；在外加磁场的作用下，磁性颗粒与液体分开，弃除液体后，再经洗脱即得到纯化的核酸分子。磁珠法利用了磁性颗粒活性基团在一定条件下可与核酸结合和解离的原理，尽可能地避免了提取过程中核酸的丢失，还能很好地去除标本中存在的干扰物质（如血红蛋白、胆红素及脂血等因素）影响，获得质量较高的核酸模板。随着磁珠法提取技术的发展，DNA提取才真正开始实现标准化、快速化和自动化。而基于磁珠法提取的商业试剂盒也得到广泛应用。这种试剂盒不需要任何有机溶剂，无需重复离心，目前可以从全血、血清、血浆、唾液、尿液、粪便、脑脊液、组织和细胞中提取高质量的DNA和RNA，且耗时更短、回收率更高。最显著的优势是可以通过机械设备实现提取过程自动化和无人源干扰。近年来分子诊断技术快速发展，随着基因测序等技术的成熟，成本进一步降低，在临床上的应用也越来越普遍。分子诊断检测的样本类型多达数十种，而处理后产物适用的检测项目也涵盖了荧光定量PCR、基因测序、基因芯片、生物质谱等各类分子生物学技术平台。然而，无论是哪一类检测项目，准确的检验结果无疑依赖于高质量的标本及标本前处理过程。因此临床分子诊断自动化趋势将逐步在国内临床实验室成为主导，而自动化首先将在目前手工操作较普及且对结果影响最大的核酸提取上实现。磁珠法提取试剂加自动核酸提取仪，就成为解决临床分子诊断样品前处理的完美组合。然而，使用生物磁珠提取核酸的过程中，也存在着一些误区。01误区1：磁珠越多，提取效果越好有很多老师喜欢在提取效果不佳的时候，增加磁珠的用量，认为磁珠多加一点，就能吸上更多的核酸，不得不说这种想法是不可取的。磁珠的主要特点是既可以分散于液体中，也可以在外加磁场作用下以固态方式和液相分离，任何试剂体系，磁珠和液体的比例都应该是有一定阈值的，超过一定的比例，过多的磁珠将因为无法均匀分散于液体中，而丧失其分散的特性，也使得洗涤过程中无法充分增加核酸磁珠和液体接触的效率。而过量的磁珠也会吸附更多的杂质，对于除杂的效果影响非常大。甚至有些时候，过多的磁珠会吸附蛋白酶、溶菌酶等在液体体系中起主要作用的功能成分，导致整个试剂盒效率低下。有很多时候，在提取效果不佳的时候，减少磁珠使用量，反而是提升提取效果的最优途径。通常情况下，磁珠法试剂盒给出的参考磁珠用量都是略微过量的，因此需要增加磁珠用量改善吸附效率的情况并不多，但如果确定是磁珠用量不足导致的提取效果不好，是可以在一定范围内通过增加磁珠用量来改善提取效果的。02误区2：试剂使用的越多，提取效果越好裂解效果不好?多加点裂解液。洗涤效果不好?多加点洗涤液。这是很多客户在使用试剂盒中的惯性思维。但是对于磁珠法而言，每增加一部分液体体积，就减少了更多的磁珠碰撞几率，而降低磁珠碰撞几率，会导致吸附率的大幅度下降。所以很多时候，虽然增加裂解液和洗涤液确实能够起到增强裂解和增强洗涤的作用，但磁珠法提取的核心是磁珠吸附核酸的效率，无法保证磁珠碰撞效率是不能保证核酸提取效率的，所以单纯增加试剂使用量改善提取效果并不一定完全有效。03误区3:洗涤次数越多，提取效果越好提取得到的核酸杂质过多时，使用者会考虑多进行几次洗涤，以得到更为纯净的核酸。增加洗涤次数确实有利于提纯核酸，但考虑到每次洗涤都会损失一定量的核酸，且增加了核酸断裂水解的可能性，所以一般来说洗涤次数控制在2~4次为宜。04误区4:样本取用的越多，提取效果越好在样本不够新鲜或者核酸含量本身就很少的情况下，往往核酸提取效果不好，很多老师就会采用多取样本的方式增加核酸提取量。但简单地增加样本取样量，有时会引入过多的杂质，超出裂解液裂解能力，也会使提取效率降低，所以并不推荐通过简单的增加样本取样量的方式来达到增加提取量的目的。如果确实是由于样本量不足而引起的提取量过低，建议在前处理先经过富集或者浓缩步骤再开始提取。或者增加裂解的完全性，使更多的核酸暴露出来也是一种解决方法。05误区5:某一种磁珠好，就应该在所有试验中效果都好磁珠的种类是多种多样的，粒径大小不同，分散性不同，磁响应时间不同，包被基础基质不同，外层修饰官能团不同，包被密度不同，官能团臂长不同，会导致磁珠特性千差万别。所以不同磁珠所适应的实验和体系也是不同的。就像同样是核酸提取的试剂，配方也并不完全相同，同样应用于核酸提取的磁珠，性质也并非完全一致。有的磁珠在常量核酸提取中表现出了更高的吸附效率，有的磁珠更适用于微量核酸提取。有的磁珠适合偏酸性系列的试剂体系，有的磁珠适合偏碱性系列的试剂体系。有的磁珠磁响应性好但是沉降速度快，更适合磁棒式自动提取仪;有的磁珠沉降速度慢但是磁响应时间长，更适合移液式自动提取仪。很少有一种磁珠能适用于所有实验的情况，除了固定的试剂盒配合，多数情况下，磁珠和试剂体系都要做一定时间的配合调整。06和某种试剂盒对比效果不好，就是磁珠不好很多客户在筛选磁珠过程中都是在已经成熟试剂体系下，简单地等量替换磁珠，用于比较磁珠效果。这样就会很容易得出某种磁珠效果不好的结论，但实际上，由于不同磁珠适合的体系和用量是不同的，往往需要调整过后才能获得更好的提取效果。

新冠肺炎爆发至今，已波及六十多个国家和地区，战“疫”是全世界面临的重要任务，而快速确诊是疫情防控的基础。根据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）》以及《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南（第四版）》记载，利用实时荧光PCR进行核酸检验是主要诊断手段。作为当下新冠肺炎确诊的“金标准”，实时荧光PCR功不可没。但通过新闻报道，我们不难发现当前诊断依然存在确诊慢、假阴性等问题。何为实时荧光PCR？为何还不能完全快速准确地诊断新冠？如何改进？今天我们就从专利视角聚焦实时荧光PCR，为大家揭开其神秘面纱。何为实时荧光PCRPCR（polymerase chainreaction，PCR）即聚合酶链式反应，是一种体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。在人类的生命周期中，细胞中1条双链DNA分子可以在DNA聚合酶（即PCR中的“P”）的作用下复制成2条一模一样的双链DNA分子，即获得2个拷贝数。PCR技术就是在试管中模拟DNA在细胞中的复制过程，将微量的DNA分子进行多次循环的复制，使得最初极为微量的DNA分子获得大量的拷贝数，进而对获得的DNA分子进行比对和检测。针对遗传物质是RNA的病毒，需要先将RNA提取出来，用酶把RNA序列逆转录（即RT）成DNA分子，然后对得到的这些DNA分子进行多次循环复制（即RT-PCR）。实时荧光PCR是在原有技术的基础上，将荧光基团加入到PCR反应体系中，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数（Ct值），病毒核酸浓度越高，Ct值越小。RT-PCR技术原理图赛默飞生命科学 Quantstudio 6 Flex 系列PCR仪二   实时荧光PCR核酸检测的无奈根据新闻报道，当前实时荧光PCR的不足集中体现在检测速度和准确度上。“一盒难求”“高度疑似却无法确诊”“确诊用时长”“假阴性”“假阳性”“出院后复阳”，以及检测过程中医护人员被感染，无不对PCR技术提出更高要求。核酸取样加样三从专利视角为PCR支招下面，我们从提高检测速度和检测准确度两方面入手，为大家介绍针对实时荧光PCR的改进。01提高检测速度实时荧光PCR检测中，耗时最长的就是DNA扩增阶段（即热循环阶段），提高热循环的效率、减少DNA扩增时间是提高检测速度的方法之一。此外，实现高通量检测也是提高检测速度的重要方法。①缩短扩增时间专利US6780617B2利用Peltier元件单独设置处理位点来冷却各个热循环步骤之间的样品，以减少相继两个步骤间的降温时间，进而减少每次热循环所需的时间。US6780617B2 附图上述专利采用的是固体热源，由于固体比热的自身缺陷，升降时间存在瓶颈。对此，专利JP3136129B2、US6472186B1更换热源种类，采用热容量小的“气体热源”，热源自身的温度升降很快，有效地将热循环扩增时间缩短到数十分钟，但稳定性不足。随着MEMS技术、微流控芯片技术的发展，微流控技术被应用到PCR扩增中，其中US9651039B2等诸多专利中均采用连续流动型PCR微流控芯片，实现了热循环由时间向空间的转换，大大缩短了扩增时间。在此基础上，为了自由设置热循环过程中样品与各温度区的接触时间，专利JP4579490B2将彼此间隔的多个温度区通过微通道连接，使样品溶液往复流经相同微通道，在其中被加热。微流控技术有效地将DNA扩增时间缩短到5分钟之内。②实现高通量检测在一个热循环中同时实现多路核酸样本的检测，即高通量检测同样能够提高检测速度。专利US6927045B2利用高通量毛细管阵列对电泳系统进行分析，核酸被可饱和而可逆地捕获在反应室，在毛细管内直接进行反应，实现高通量检测。专利US8467061B2通过设置光源切换方式实现不同激发光激发，实现多通道检测。专利申请CN108181239A利用转盘等结构设置多个LED光源，形成多个检测通道。专利JP6564441B2通过优化系统的内部结构和自动化检测流程，实现高通量检测。US6927045B2附图02提高检测准确度相较于检测速度，提高检测准确性更为关键，假阴性患者的出现，可能会感染更多人。①防止假阴性在实时荧光PCR检测中，假阴性一般是由于PCR扩增失败导致的，如提取过程中靶基因的丢失、提取试剂残留、标本中抑制物去除不彻底、扩增仪孔间温度差异等。现有技术中，避免假阴性最有效的措施是建立“内标”。专利CN101717829B公开了“非竞争性内标”，在同一试管内用两对引物同步扩增来自同一DNA的一段靶序列和另一段内标序列。通过比较两种序列的扩增产量，可对靶序列定量。通过抗干扰实验判断PCR检测的稳定性，通过检测人工污染样品判断扩增内标是否指示假阴性。专利CN102424852B公开了“竞争性内标”，构建一个扩增效率、引物结合位点与靶基因相同的、仅探针结合位点不同的内标，在同一反应管内，靶基因与内标物和引物竞争性结合，进行同步扩增。靶基因的量可通过与产生相同产物的竞争物的量相比较而得到。②防止假阳性假阳性一般是由于PCR扩增污染导致的，主要是样品提取或扩增过程中，相邻样品间的交叉污染造成的。避免假阳性的手段包括酶处理以及实验设备优化等。通过添加酶，破坏PCR反应液中DNA的能力，DNA被降解，而DNA聚合酶活性不受影响。这种酶处理的方法大致相同，例如专利AU636499B2通过向扩增产物中引入至少一种修饰物从而降低或消除由污染的扩增产物产生的背景值，在将新测试试样中的靶序列扩增之前，对试样进行处理，选择性地除去该污染扩增产物，使之不能在新测试试样中扩增。预防假阳性，关键在于防止污染，尤其是“样品—样品”间的污染，其主要存在形式是气溶胶污染和样品残留污染，例如离心管打开时，形成液体飞溅或气溶胶、移液操作不当等。针对上述情况，可以通过对实验设备进行优化，降低样品间的交叉污染，提高检测的准确性。专利US9517472B2从改善样品在不同模块之间的分配方式出发，采用例如气泵、磁场、电场等方式实现试剂或样品在密封空间内的分配，极大地减少了气溶胶的产生，在减少样品间交叉污染的同时，也能够更好地保障检测人员的安全。US9517472B2附图微流控技术在PCR中的应用，能够实现检测仪器的集成化和全封闭设计，将病毒的提取、分离、扩增、检测都集成在芯片上。待取样完成后，操作人员仅需将添加好试样的微流控芯片放置在检测仪器中，密封好检测仪器，之后所有的操作均可自动化完成，极大地避免了气溶胶的产生，防止样品间的交叉污染。例如专利CN102286358B、专利申请US2019046989A1。US2019046989A1附图当然，上述专利中涉及的方法仅是在实时荧光PCR检测过程中采取的手段，在实际的病毒检测中，从采样、贮存、运输、到核酸提取、再到仪器检测，改进可能导致检测结果出现偏差的各个环节都有助于提高准确性。除了不断提高技术和实验能力，采用多种检测手段相结合、取长补短，也能够进一步提高检测的准确性。除核酸检测外，抗原快速检测、抗体检测等都是病毒检测的手段。目前，针对新冠病毒的抗体诊断检测正在紧锣密鼓研发中，例如利用胶体金检测试剂进行体外定性检测人血清、血浆、全血样本，测试其中的IgM/IgG抗体浓度值，操作简单，15分钟即可肉眼判读结果，其可作为核酸检测的补充或协同，通过联合检测提高筛查排查率。上述血清学检测方法已被正式采纳，作为新冠肺炎第七版诊疗方案的确诊标准。通过以上对专利技术的分析可以发现，针对实时荧光PCR的改进有很多，但专利技术到商业应用，还有诸多问题需要考虑。随着技术的不断发展，实时荧光PCR定会日臻完善，第三代数字PCR也在高速发展普及。我们可以满怀希望，在不久的将来定能实现核酸的快速准确安全检测。##病魔照妖镜#本期作者光电技术发明审查部分析技术室高世芝 林朋飞（部分图片来源于网络）